Peptidreinigung

Effektive Peptidreinigungstechnologien sind mit der zunehmenden Herstellung synthetischer Peptide für die Forschung noch wichtiger geworden. Auf dieser Seite werden viele Teile der Peptidreinigung behandelt, die während der Peptidsynthese auftreten, verschiedene Peptidreinigungsmethoden und -strategien sowie wahrscheinliche Verunreinigungen, die während der Synthese entfernt werden können.

Da Peptide komplizierte Moleküle sind, funktionieren andere Reinigungsmethoden für andere organische Verbindungen möglicherweise nicht für sie. Daher muss der Maximierung von Effizienz und Ausbeute große Aufmerksamkeit geschenkt werden, um den Kunden während der Synthese das reinste Peptid zum niedrigsten praktikablen Preis zu liefern. Während Reinigungsverfahren auf Kristallisationsbasis typischerweise bei anderen Substanzen wirksam sind, beruhen viele Peptidreinigungsverfahren, wie die Hochdruck-Reversed-Phase-Chromatographie, auf Chromatographieprinzipien.

Spezifische Verunreinigungen in Peptiden loswerden

Wie bereits erwähnt, muss das fertig synthetisierte Peptid für Forschungszwecke so rein wie möglich sein. Die minimal zulässigen Reinheitsgrade variieren je nach Forschungsziel; In-vitro-Untersuchungen erfordern beispielsweise häufig einen wesentlich höheren Reinheitsstandard (mehr als 95 Prozent) als ein ELISA-Standard zur Messung von Antikörpertitern (annehmbare Mindestreinheit größer als 70 Prozent). Unabhängig davon muss der erforderliche Reinheitsgrad eingehalten werden. Das Verständnis der Arten von Verunreinigungen und ihrer Natur ist entscheidend, um sicherzustellen, dass die Reinheitskriterien erfüllt werden. Danach kann das geeignete Reinigungsverfahren (oder Methoden) verwendet werden.

Geeignete Beispiele für spezifische Verunreinigungen, die sich während der Peptidsynthese entwickeln könnten, sind labile Amidbindungshydizes, Deletionssequenzen, die hauptsächlich bei der Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) erzeugt werden, Diastereomere, Insertionspeptide und Nebenprodukte, die nach Entfernung durch Schutzgruppen gebildet werden. Während der Peptidherstellung kann diese letztere Verunreinigung auftreten. Darüber hinaus können polymere Versionen eines synthetisierbaren Peptids als Nebenprodukt der zyklischen Peptidproduktion mit Disulfidbindungen verwendet werden.

Tatsächlich muss das Reinigungsverfahren das gewünschte Peptid erfolgreich aus einer komplexen Mischung von Chemikalien und potentiellen Verunreinigungen extrahieren.

Reinigungsstrategie für Peptide

Die Reinigungstechnik wäre in einer idealen Welt so einfach wie möglich, mit nur wenigen Schritten, um die gewünschte Reinheit zu erreichen. Wenn jedoch zwei oder mehr Reinigungsverfahren nacheinander durchgeführt werden, können sie typischerweise gute Ergebnisse liefern, insbesondere wenn sie unterschiedliche Chromatographieprinzipien verwenden. Ionenaustauschchromatographie, die beispielsweise mit Umkehrphasenchromatographie verwendet wird, kann ein hochreines Endprodukt erzeugen.

Die Entfernung der meisten Verunreinigungen aus der synthetischen Peptidmischung ist normalerweise der erste Schritt bei der Peptidreinigung. Viele in dieser Phase eliminierte Verunreinigungen werden jedoch während des letzten Entschützungsschrittes der Peptidsynthese ungeladen und mit niedrigem Molekulargewicht erzeugt. Während also diese erste Reinigungsstufe viele Verunreinigungen entfernen kann, kann eine zweite Reinigungsstufe implementiert werden, wenn ein höherer Reinheitsgrad gewünscht wird. Wie bereits erwähnt, ist diese zweite Stufe ein Polierschritt und recht erfolgreich, insbesondere wenn ein komplementäres chromatographisches Konzept verwendet wird.

Verfahren zur Reinigung von Peptiden

Puffervorbereitungssysteme, Lösungsmittelversorgungssysteme, Fraktionierungssysteme, Datenerfassungssysteme und kritische Säulen und Detektoren sind nur einige Subsysteme und Elemente, aus denen ein Peptidreinigungssystem besteht. Tatsächlich ist die Säule das Herzstück des Reinigungssystems, und die spezifischen Eigenschaften der Säule können entscheidend für die Effizienz des Prozesses sein. Beispielsweise kann eine Säule Glas- oder Stahlmerkmale sowie statische oder dynamische Kompressionsmodi aufweisen, die alle das Endreinigungsergebnis beeinflussen können.

Darüber hinaus müssen alle Reinigungsprozesse den aktuellen Good entsprechen

Chromatographie mit Affinität (AC)

Dieses Verfahren verwendet ein Peptid und einen spezifischen Liganden, die an eine chromatographische Matrix gekoppelt sind, um Peptide zu isolieren. Ungebundenes Material wird weggewaschen, wenn das gewünschte Peptid an den Liganden bindet. Es ist auch erwähnenswert, dass diese Bindung reversibel ist. Die Umstände werden dann geändert, um die Desorption günstiger zu machen, was ausdrücklich oder ad hoc erfolgen kann. Ein kompetitiver Ligand wird für die selektive Desorption verwendet, während pH, Polarität und Ionenstärke für die unspezifische Desorption verwendet werden. Die gereinigte Form des spezifischen Peptids wird dann gesammelt. AC hat eine hohe Probenkapazität sowie eine hohe Auflösung.

Die Ionenaustauschchromatographie ist eine Art der Chromatographie, die Ionen verwendet, um (IEX)

Dieses Reinigungsverfahren nutzt Ladungsschwankungen zwischen Peptiden in einer Mischung. Wenn chromatographische Medien mit entgegengesetzter Ladung verwendet werden, werden Peptide einer Orientierung getrennt. Peptide werden in eine Säule eingespeist und binden; danach werden die Bedingungen so geändert, dass die gebundenen Verbindungen auf verschiedene Weise eluiert werden. Die Salzmenge in der Lösung oder der pH-Wert der Lösung sind die Variablen, die geändert werden. Salz (NaCl) wird üblicherweise verwendet, um die Mischung zu eluieren. Während des Bindungsvorgangs wird das benötigte Peptid aufkonzentriert und in gereinigter Form gesammelt. IEX ist eine Methode mit hoher Auflösung und Kapazität.

Chromatographie hydrophober Wechselwirkungen (HIC)

Bei dieser Technik wird das Prinzip der Hydrophobie verwendet. Die Wechselwirkung eines Peptids mit der hydrophoben Oberfläche eines chromatischen Mediums ermöglicht die Isolierung der gewünschten Peptide. Darüber hinaus ist dieser Kontakt reversibel, was die Konzentration und Reinigung des Peptids ermöglicht. Darüber hinaus verbessert ein Puffer mit hoher Ionenstärke den Prozess, was HIC zu einem hochwirksamen Reinigungsansatz macht, der nach einem Salzelutions-Reinigungsverfahren (wie der IEX-Technik) verwendet werden kann.

Proben in einer Lösung mit hoher Ionenstärke verbinden sich und werden während der HIC auf eine Säule gegeben. Anschließend führt die Elution mit niedrigeren Salzkonzentrationen zu einer differentiellen Elution der gebundenen Verbindungen. Die Verwendung von Ammoniumsulfat zum Verdünnen der Probe über einen abnehmenden Gradienten ist eine gängige Anwendungsweise. Danach wird das gewünschte Peptid in konzentriertem und gereinigtem Zustand extrahiert. Dadurch hat HIC ein hohes Maß an Auflösung und Probenkapazität.

Gelfiltration (GF)

Durch Ausnutzung des Unterschieds der molekularen Dimensionen zwischen den Peptiden und den Verunreinigungen isoliert die Gelfiltration Peptide. Folglich wird GF nur in Proben mit bescheidenem Volumen verwendet. Auf der anderen Seite bietet diese Methode jedoch ein gutes Ergebnis.

Chromatographie in der Umkehrphase (RPC)

Diese Reinigungstechnik bietet eine hohe Auflösung und trennt Peptide von Verunreinigungen, indem sie die reversible Wechselwirkung zwischen Zielmolekülen und der hydrophoben Oberfläche eines chromatographischen Mediums ausnutzt. Die Umstände werden dann so geändert, dass die gebundenen Verbindungen in einer anderen Reihenfolge eluiert werden. Da die anfängliche Bindung aufgrund der Natur von Reversed-Phase-Matrices fest ist, werden häufig organische Lösungsmittel und andere Additive zur Elution benötigt.

Die Elution erfolgt normalerweise durch Erhöhung der Konzentration organischer Lösungsmittel, meistens Acetonitril. Die potenten Moleküle, die aus dem Bindungsprozess stammen, werden anschließend gereinigt. Bei Peptiden und Oligonukleotidproben wird RPC häufig als Polierschritt verwendet. Es eignet sich hervorragend für Peptid-Mapping und andere analytische Trennungen. RPC ist jedoch kein ideales Reinigungsverfahren, wenn Aktivitätsrückgewinnung und Wiederherstellung einer geeigneten Tertiärstruktur erforderlich sind. Dies liegt daran, dass organische Lösungsmittel viele Peptide denaturieren können.

Einhaltung von GMP

Besondere Aufmerksamkeit muss der GMP-Compliance während der gesamten Peptidsynthese- und Aufreinigungsvorgänge geschenkt werden. Dies stellt sicher, dass das fertige Peptid rein und von ausgezeichneter Qualität ist. Chemische und analytische Methoden müssen gründlich dokumentiert werden, um der GMP zu entsprechen. Vor Beginn des Herstellungsprozesses müssen Testverfahren und Anforderungen festgelegt werden, um sicherzustellen, dass der Prozess kontrolliert und wiederholbar ist.

Die Aufreinigungsphase der Peptidsynthese hat sehr strenge GMP-Anforderungen. Dieser Schritt ist spät im Gesamtsyntheseprozess und beeinflusst die Qualität des endgültigen Peptids erheblich. Als Ergebnis müssen wesentliche Aktionen und Parameter und ihre Grenzen festgelegt werden, damit der Prozess innerhalb dieser vorbestimmten Beschränkungen wiederholbar ist.

• Die Säulenbeladung ist ein kritischer Parameter im Peptidreinigungsprozess.
• Die Flussrate.
• Die Leistung der Spalten.
• Reinigungsmethoden für die Säulen.
• Die Zusammensetzung des Elutionspuffers.
• Die Zeit, die für das Speichern von Daten aufgewendet wird.
• Fraktionen werden gepoolt.

My Peptides folgt den strengsten Synthese- und Reinigungsprozessen der Branche. Als Ergebnis unseres Engagements für diese Kriterien kann unsere Organisation Peptide herstellen, die reiner als 99 Prozent sind und für jedes Forschungsprojekt oder jede Anwendung geeignet sind.