Purification Peptidique

Les technologies efficaces de purification des peptides sont devenues encore plus essentielles avec la fabrication croissante de peptides synthétiques pour la recherche. Cette page passera en revue de nombreuses parties de la purification des peptides qui se produisent pendant la synthèse des peptides, les différentes méthodes et stratégies de purification des peptides et les contaminants probables qui peuvent être éliminés pendant la synthèse.

Parce que les peptides sont des molécules compliquées, d’autres méthodes de purification pour d’autres composés organiques peuvent ne pas fonctionner pour eux. En conséquence, une attention considérable doit être accordée à la maximisation de l’efficacité et du rendement pour fournir aux clients le peptide le plus pur au prix le plus bas possible pendant la synthèse. Alors que les méthodes de purification basées sur la cristallisation sont généralement efficaces avec d’autres substances, de nombreuses méthodes de purification de peptides, telles que la chromatographie en phase inverse à haute pression, reposent sur les principes de la chromatographie.

Se débarrasser des impuretés spécifiques dans les peptides

Comme indiqué précédemment, à des fins de recherche, le peptide synthétisé final doit être aussi pur que possible. Les niveaux de pureté minimaux admissibles varient en fonction de l’objectif de la recherche; par exemple, les investigations in vitro nécessitent souvent un standard de pureté sensiblement plus élevé (plus de 95 pour cent) qu’un standard ELISA pour mesurer les titres d’anticorps (pureté minimale acceptable supérieure à 70 pour cent). Quoi qu’il en soit, le niveau de pureté requis doit être atteint. Comprendre les types d’impuretés et leur nature est essentiel pour s’assurer que les critères de pureté sont satisfaits. Après cela, la procédure (ou les méthodes) de purification appropriée peut être utilisée.

Des exemples appropriés d’impuretés spécifiques qui pourraient se développer pendant la synthèse peptidique sont les hydrures de liaison amide labile, les séquences de délétion générées principalement sur la synthèse peptidique en phase solide (SPPS), les diastéréoisomères, les peptides d’insertion et les sous-produits formés après élimination par les groupes de protection. Lors de la production de peptides, cette dernière impureté peut apparaître. En outre, des versions polymères d’un peptide synthétisé peuvent être utilisées comme sous-produit de la production de peptides cycliques avec des liaisons disulfure.

En effet, la méthode de purification doit réussir à extraire le peptide souhaité d’un mélange complexe de produits chimiques et de contaminants potentiels.

Stratégie de purification pour les peptides

La technique de purification serait aussi simple que possible dans un monde idéal, avec seulement quelques étapes nécessaires pour atteindre la pureté souhaitée. Cependant, lorsque deux ou plusieurs méthodes de purification sont exécutées en séquence, elles peuvent généralement produire de bons résultats, en particulier si elles utilisent des principes de chromatographie différents. La chromatographie par échange d’ions utilisée avec la chromatographie en phase inverse, par exemple, peut produire un produit final très pur.

L’élimination de la plupart des contaminants du mélange de peptides synthétiques est généralement l’étape initiale de la purification des peptides. Cependant, de nombreux contaminants éliminés dans cette phase sont créés lors de la dernière étape de déprotection de la synthèse peptidique, non chargés, et de faible poids moléculaire. Ainsi, alors que cette première étape de purification permet d’éliminer de nombreux contaminants, une seconde étape de purification peut être mise en œuvre si un niveau de pureté plus élevé est souhaité. Comme discuté précédemment, cette deuxième étape est une étape de polissage et est assez réussie, en particulier lors de l’utilisation d’un concept chromatographique complémentaire.

Processus de purification des peptides

Les systèmes de préparation de tampon, les systèmes d’alimentation en solvant, les systèmes de fractionnement, les systèmes de collecte de données et les colonnes et détecteurs critiques ne sont que quelques sous-systèmes et éléments qui composent un système de purification de peptides. En effet, le cœur du système de purification est la colonne, et les qualités spécifiques de la colonne peuvent être cruciales pour l’efficacité du procédé. Par exemple, une colonne peut avoir des caractéristiques en verre ou en acier, ainsi que des modes de compression statiques ou dynamiques, qui peuvent tous influencer le résultat final de la purification.

De plus, tous les processus de purification doivent être conformes aux bonnes

Chromatographie avec affinité (AC)

Cette méthode utilise un peptide et un ligand spécifique couplés à une matrice chromatographique pour isoler des peptides. Le matériau non lié est éliminé par lavage au fur et à mesure que le peptide souhaité se lie au ligand. Il est également intéressant de noter que ce lien est réversible. Les circonstances sont alors modifiées pour rendre la désorption plus favorable, ce qui peut être fait expressément ou ad hoc. Un ligand compétitif est utilisé pour la désorption sélective, tandis que le pH, la polarité et la force ionique sont utilisés pour la désorption non spécifique. La forme purifiée du peptide spécifique est ensuite collectée. AC a une capacité d’échantillonnage élevée ainsi qu’une haute résolution.

La chromatographie par échange d’ions est un type de chromatographie qui utilise des ions pour (IEX)

Cette méthode de purification tire parti des variations de charge entre les peptides dans un mélange. Lorsque des supports chromatographiques avec la charge opposée sont utilisés, les peptides d’une orientation sont séparés. Les peptides sont introduits dans une colonne et se lient ; après cela, les conditions sont modifiées de telle sorte que les composés liés sont élués de diverses manières. La quantité de sel dans la solution ou le niveau de pH de la solution sont les variables qui sont modifiées. Le sel (NaCl) est couramment utilisé pour éluer le mélange. Pendant la procédure de liaison, le peptide requis est concentré et collecté sous forme purifiée. IEX est une méthode avec une résolution et une capacité élevées.

Chromatographie des interactions hydrophobes (HIC)

Le principe d’hydrophobie est utilisé dans cette technique. L’interaction d’un peptide avec la surface hydrophobe d’un milieu chromatique permet l’isolement des peptides recherchés. De plus, ce contact est réversible, permettant la concentration et la purification du peptide. De plus, un tampon avec une force ionique élevée améliore le processus, faisant du HIC une approche de purification très efficace à utiliser après une procédure de purification par élution de sel (comme la technique IEX).

Les échantillons d’une solution à haute force ionique se lient et sont placés sur une colonne pendant le HIC. Ensuite, l’élution avec des concentrations de sel plus faibles conduit à une élution différentielle des composés liés. L’utilisation de sulfate d’ammonium pour diluer l’échantillon sur un gradient décroissant est un mode d’application courant. Après cela, le peptide souhaité est extrait dans un état concentré et purifié. En conséquence, HIC a un niveau élevé de résolution et de capacité d’échantillonnage.

Gels filtration (GF)

En exploitant la différence de dimensions moléculaires entre les peptides et les contaminants, la filtration sur gel isole les peptides. Par conséquent, le GF n’est utilisé que dans des échantillons de volume modeste. Mais, d’un autre côté, cette méthode offre un bon résultat.

Chromatographie en phase inversée (RPC)

Cette technique de purification offre une haute résolution et sépare les peptides des impuretés en exploitant l’interaction réversible entre les molécules cibles et la surface hydrophobe d’un support chromatographique. Les circonstances sont alors modifiées pour que les composés liés soient élués dans un ordre différent. Étant donné que la liaison initiale est solide en raison de la nature des matrices en phase inversée, des solvants organiques et d’autres additifs sont fréquemment nécessaires pour l’élution.

L’élution est généralement réalisée en augmentant la concentration de solvants organiques, le plus souvent l’acétonitrile. Les molécules puissantes issues du processus de liaison sont ensuite purifiées. Avec des échantillons de peptides et d’oligonucléotides, le RPC est fréquemment utilisé comme étape de polissage. Il est excellent pour la cartographie peptidique et d’autres séparations analytiques. Cependant, la RPC n’est pas une procédure de purification idéale si la récupération d’activité et la restauration d’une structure tertiaire appropriée sont nécessaires. En effet, les solvants organiques peuvent dénaturer de nombreux peptides.

Respect des BPF

Une attention particulière doit être portée au respect des BPF tout au long des opérations de synthèse et de purification des peptides. Cela garantit que le peptide final est pur et d’excellente qualité. Les méthodes chimiques et analytiques doivent être soigneusement documentées pour se conformer aux BPF. Avant de démarrer le processus de fabrication, des procédures de test et des exigences doivent être définies pour garantir que le processus est contrôlé et reproductible.

La phase de purification de la synthèse peptidique a des exigences GMP très strictes. Cette étape est tardive dans le processus de synthèse global et a un impact considérable sur la qualité du peptide final. En conséquence, des actions et des paramètres essentiels doivent être établis et leurs limites pour que le processus soit reproductible dans le cadre de ces contraintes prédéterminées.

• Le chargement de la colonne est un paramètre critique dans le processus de purification des peptides.
• Le débit.
• La performance des colonnes.
• Méthodes de nettoyage des colonnes.
• La composition du tampon d’élution.
• Le temps passé dans le processus de stockage des données.
• Les fractions sont regroupées.

My Peptides suit les processus de synthèse et de purification les plus stricts de l’industrie. Grâce à notre engagement envers ces critères, notre organisation peut produire des peptides plus purs à 99 % et adaptés à tout projet de recherche ou application.