Purificación de péptidos

Las tecnologías efectivas de purificación de péptidos se han vuelto aún más esenciales con la creciente fabricación de péptidos sintéticos para la investigación. Esta página repasará muchas partes de la purificación de péptidos que ocurren durante la síntesis de péptidos, diferentes métodos y estrategias de purificación de péptidos y probables contaminantes que se pueden eliminar durante la síntesis.

Debido a que los péptidos son moléculas complicadas, es posible que otros métodos de purificación de otros compuestos orgánicos no funcionen para ellos. Como resultado, se debe prestar una atención considerable a maximizar la eficiencia y el rendimiento para suministrar a los clientes el péptido más puro al precio más bajo posible durante la síntesis. Si bien los métodos de purificación basados en cristalización suelen ser eficaces con otras sustancias, muchos métodos de purificación de péptidos, como la cromatografía de fase inversa de alta presión, se basan en principios de cromatografía.

Deshacerse de impurezas específicas en péptidos

Como se indicó anteriormente, para fines de investigación, el péptido sintetizado final debe ser lo más puro posible. Los niveles mínimos de pureza permitidos varían según el objetivo de la investigación; por ejemplo, las investigaciones in vitro a menudo requieren un estándar de pureza sustancialmente más alto (más del 95%) que un estándar ELISA para medir los títulos de anticuerpos (pureza mínima aceptable superior al 70%). Independientemente, se debe alcanzar el nivel de pureza requerido. Comprender los tipos de impurezas y su naturaleza es fundamental para garantizar que se cumplan los criterios de pureza. Después de eso, se puede utilizar el procedimiento (o métodos) de purificación adecuados.

Ejemplos apropiados de impurezas específicas que podrían desarrollarse durante la síntesis de péptidos son los enlaces de amida lábiles hidratados, secuencias de deleción generadas principalmente en la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS), diastereómeros, péptidos de inserción y subproductos formados después de la eliminación por grupos de protección. Durante la producción de péptidos, puede producirse esta última impureza. Además, las versiones poliméricas de un péptido sintetizable pueden usarse como subproducto de la producción de péptidos cíclicos con enlaces disulfuro.

De hecho, el método de purificación debe extraer con éxito el péptido deseado de una mezcla compleja de sustancias químicas y contaminantes potenciales.

Estrategia de purificación de péptidos

La técnica de purificación sería lo más fácil posible en un mundo ideal, con solo unas pocas etapas requeridas para lograr la pureza deseada. Sin embargo, cuando se ejecutan dos o más métodos de purificación en secuencia, normalmente pueden producir buenos resultados, especialmente si utilizan principios de cromatografía diferentes. La cromatografía de intercambio iónico utilizada con cromatografía de fase inversa, por ejemplo, puede producir un producto final de gran pureza.

La eliminación de la mayoría de los contaminantes de la mezcla de péptidos sintéticos suele ser el paso inicial en la purificación de péptidos. Sin embargo, muchos contaminantes eliminados en esta fase se crean durante el último paso de desprotección de la síntesis de péptidos, sin carga y de bajo peso molecular. Por tanto, aunque esta primera etapa de purificación puede eliminar muchos contaminantes, se puede implementar una segunda etapa de purificación si se desea un nivel de pureza más alto. Como se discutió anteriormente, esta segunda etapa es un paso de pulido y tiene bastante éxito, especialmente cuando se usa un concepto cromatográfico complementario.

Procesos de purificación de péptidos

Los sistemas de preparación de tampones, los sistemas de suministro de disolventes, los sistemas de fraccionamiento, los sistemas de recopilación de datos y las columnas y detectores críticos son solo algunos subsistemas y elementos que componen un sistema de purificación de péptidos. De hecho, el corazón del sistema de purificación es la columna, y las cualidades específicas de la columna pueden ser cruciales para la eficacia del proceso. Por ejemplo, una columna puede tener características de vidrio o acero, así como modos de compresión estáticos o dinámicos, todos los cuales pueden influir en el resultado final de la purificación.

Además, todos los procesos de purificación deben adherirse a los buenos

Cromatografía con afinidad (AC)

Este método utiliza un péptido y un ligando específico acoplados a una matriz cromatográfica para aislar péptidos. El material no unido se elimina por lavado a medida que el péptido deseado se une al ligando. También vale la pena señalar que este vínculo es reversible. A continuación, se modifican las circunstancias para que la desorción sea más favorable, lo que puede realizarse de forma expresa o ad hoc. Se usa un ligando competitivo para la desorción selectiva, mientras que el pH, la polaridad y la fuerza iónica se usan para la desorción inespecífica. A continuación, se recoge la forma purificada del péptido específico. AC tiene una gran capacidad de muestra y una alta resolución.

La cromatografía de intercambio iónico es un tipo de cromatografía que utiliza iones para (IEX)

Este método de purificación aprovecha las variaciones de carga entre los péptidos de una mezcla. Cuando se utilizan medios cromatográficos con la carga opuesta, se separan los péptidos de una orientación. Los péptidos se introducen en una columna y se unen; después de eso, las condiciones se alteran de modo que los compuestos unidos se eluyan de diversas formas. La cantidad de sal en la solución o el nivel de pH de la solución son las variables que se modifican. La sal (NaCl) se usa comúnmente para eluir la mezcla. Durante el procedimiento de unión, el péptido requerido se concentra y se recolecta en forma purificada. IEX es un método de alta resolución y capacidad.

Cromatografía de interacciones hidrofóbicas (HIC)

En esta técnica se utiliza el principio de hidrofobicidad. La interacción de un péptido con la superficie hidrófoba de un medio cromático permite el aislamiento de los péptidos deseados. Además, este contacto es reversible, lo que permite la concentración y purificación del péptido. Además, un tampón con una alta fuerza iónica mejora el proceso, lo que convierte a HIC en un método de purificación altamente eficaz para usar después de un procedimiento de purificación por elución de sal (como la técnica IEX).

Las muestras en una solución de alta fuerza iónica se unen y se colocan en una columna durante la HIC. Después de eso, la elución con concentraciones de sal más bajas conduce a la elución diferencial de los compuestos unidos. El uso de sulfato de amonio para diluir la muestra en un gradiente decreciente es una forma común de aplicación. Después de eso, el péptido deseado se extrae en un estado concentrado y purificado. Como resultado, HIC tiene un alto nivel de resolución y capacidad de muestra.

Filtración de geles (GF)

Aprovechando la diferencia de dimensiones moleculares entre los péptidos y los contaminantes, la filtración en gel aísla los péptidos. En consecuencia, GF se usa solo en muestras de volumen modesto. Pero, por otro lado, este método ofrece un buen resultado.

Cromatografía en fase inversa (RPC)

Esta técnica de purificación proporciona una alta resolución y separa los péptidos de las impurezas aprovechando la interacción reversible entre las moléculas diana y la superficie hidrofóbica de un medio cromatográfico. A continuación, se cambian las circunstancias para que los compuestos unidos se eluyan en un orden diferente. Debido a que la unión inicial es sólida debido a la naturaleza de las matrices de fase inversa, con frecuencia se requieren disolventes orgánicos y otros aditivos para la elución.

La elución se realiza normalmente aumentando la concentración de disolventes orgánicos, más a menudo acetonitrilo. Las potentes moléculas que provienen del proceso de unión se purifican posteriormente. Con péptidos y muestras de oligonucleótidos, el RPC se usa con frecuencia como paso de pulido. Es excelente para el mapeo de péptidos y otras separaciones analíticas. Sin embargo, la RPC no es un procedimiento de purificación ideal si se requiere la recuperación de la actividad y la restauración a una estructura terciaria adecuada. Esto se debe a que los disolventes orgánicos pueden desnaturalizar muchos péptidos.

Cumplimiento de las BPF

Se debe prestar especial atención al cumplimiento de las GMP en todas las operaciones de síntesis y purificación de péptidos. Esto asegura que el péptido final sea puro y de excelente calidad. Los métodos químicos y analíticos deben documentarse minuciosamente para cumplir con las BPF. Antes de comenzar el proceso de fabricación, se deben establecer procedimientos de prueba y requisitos para garantizar que el proceso sea controlado y repetible.

La fase de purificación de la síntesis de péptidos tiene requisitos GMP muy estrictos. Este paso es tardío en el proceso de síntesis general e impacta sustancialmente en la calidad del péptido final. Como resultado, se deben establecer acciones y parámetros esenciales y sus límites para que el proceso sea repetible dentro de esas restricciones predeterminadas.

• La carga de la columna es un parámetro crítico en el proceso de purificación de péptidos.
• La tasa de flujo.
• El desempeño de las columnas.
• Métodos de limpieza de las columnas.
• La composición del tampón de elución.
• La cantidad de tiempo invertido en el proceso de almacenamiento de datos.
• Las fracciones se agrupan.

My Peptides sigue los procesos de síntesis y purificación más estrictos de la industria. Como resultado de nuestro compromiso con estos criterios, nuestra organización puede producir péptidos con una pureza superior al 99% y aptos para cualquier proyecto de investigación o aplicación.