Purificazione dei peptidi

Le tecnologie efficaci di purificazione dei peptidi sono diventate ancora più essenziali con la crescente produzione di peptidi sintetici per la ricerca. Questa pagina esaminerà molte parti della purificazione dei peptidi che si verificano durante la sintesi dei peptidi, diversi metodi e strategie di purificazione dei peptidi e probabili contaminanti che possono essere rimossi durante la sintesi.

Poiché i peptidi sono molecole complicate, altri metodi di purificazione per altri composti organici potrebbero non funzionare per loro. Di conseguenza, è necessario prestare molta attenzione alla massimizzazione dell’efficienza e della resa per fornire ai clienti il peptide più puro al prezzo più basso possibile durante la sintesi. Mentre i metodi di purificazione basati sulla cristallizzazione sono generalmente efficaci con altre sostanze, molti metodi di purificazione di peptidi, come la cromatografia in fase inversa ad alta pressione, si basano sui principi della cromatografia.

Sbarazzarsi di impurezze specifiche nei peptidi

Come affermato in precedenza, per scopi di ricerca, il peptide sintetizzato finale deve essere il più puro possibile. I livelli di purezza minimi consentiti variano a seconda dell’obiettivo della ricerca; ad esempio, le indagini in vitro richiedono spesso uno standard di purezza sostanzialmente più elevato (più del 95%) rispetto a uno standard ELISA per misurare i titoli anticorpali (purezza minima accettabile maggiore del 70%). Indipendentemente da ciò, il livello di purezza richiesto deve essere soddisfatto. Comprendere i tipi di impurità e la loro natura è fondamentale per garantire che i criteri di purezza siano soddisfatti. Successivamente, è possibile utilizzare la corretta procedura (o metodi) di purificazione.

Esempi appropriati di impurezze specifiche che potrebbero svilupparsi durante la sintesi peptidica sono l’idrolisi del legame ammidico labile, le sequenze di delezione generate principalmente sulla sintesi peptidica in fase solida (SPPS), i diastereomeri, i peptidi di inserzione e i sottoprodotti formati dopo la rimozione da parte dei gruppi di protezione. Durante la produzione di peptidi, può verificarsi quest’ultima impurità. Inoltre, le versioni polimeriche di un peptide sintetizzabile possono essere utilizzate come sottoprodotto della produzione di peptidi ciclici con legami disolfuro.

In effetti, il metodo di purificazione deve estrarre con successo il peptide desiderato da una complessa miscela di sostanze chimiche e potenziali contaminanti.

Strategia di purificazione per i peptidi

La tecnica di purificazione sarebbe il più semplice possibile in un mondo ideale, con solo poche fasi necessarie per raggiungere la purezza desiderata. Tuttavia, quando due o più metodi di purificazione vengono eseguiti in sequenza, in genere possono produrre buoni risultati, soprattutto se utilizzano principi cromatografici diversi. La cromatografia a scambio ionico utilizzata con la cromatografia in fase inversa, ad esempio, può produrre un prodotto finale altamente puro.

La rimozione della maggior parte dei contaminanti dalla miscela di peptidi sintetici è solitamente la fase iniziale della purificazione dei peptidi. Tuttavia, molti contaminanti eliminati in questa fase vengono creati durante l’ultima fase di deprotezione della sintesi peptidica, non caricati e a basso peso molecolare. Pertanto, mentre questo primo stadio di purificazione può rimuovere molti contaminanti, è possibile implementare un secondo passaggio di purificazione se si desidera un livello di purezza più elevato. Come discusso in precedenza, questa seconda fase è una fase di lucidatura ed è piuttosto efficace, soprattutto quando si utilizza un concetto cromatografico complementare.

Processi per la purificazione dei peptidi

Sistemi di preparazione del tampone, sistemi di fornitura di solventi, sistemi di frazionamento, sistemi di raccolta dati e colonne e rivelatori critici sono solo alcuni sottosistemi ed elementi che costituiscono un sistema di purificazione di peptidi. Il cuore del sistema di depurazione è infatti la colonna e le qualità specifiche della colonna possono essere determinanti per l’efficacia del processo. Ad esempio, una colonna può avere caratteristiche in vetro o acciaio, nonché modalità di compressione statica o dinamica, che potrebbero influenzare il risultato finale della purificazione.

Inoltre, tutti i processi di purificazione devono aderire all’attuale Good

Cromatografia con affinità (AC)

Questo metodo utilizza un peptide e un ligando specifico accoppiato a una matrice cromatografica per isolare i peptidi. Il materiale non legato viene lavato via quando il peptide desiderato si lega al ligando. Vale anche la pena notare che questo legame è reversibile. Le circostanze vengono poi modificate per rendere più favorevole il desorbimento, che può essere fatto espressamente o ad hoc. Un ligando competitivo viene utilizzato per il desorbimento selettivo, mentre pH, polarità e forza ionica vengono utilizzati per il desorbimento non specifico. Viene quindi raccolta la forma purificata del peptide specifico. AC ha un’elevata capacità di campionamento e un’alta risoluzione.

La cromatografia a scambio ionico è un tipo di cromatografia che utilizza ioni per (IEX)

Questo metodo di purificazione sfrutta le variazioni di carica tra i peptidi in una miscela. Quando si utilizzano mezzi cromatografici con la carica opposta, i peptidi di un orientamento vengono separati. I peptidi vengono inseriti in una colonna e si legano; dopo di che, le condizioni vengono alterate in modo tale che i composti legati vengono eluiti in modi diversi. La quantità di sale nella soluzione o il livello di pH della soluzione sono le variabili che vengono modificate. Il sale (NaCl) è comunemente usato per eluire la miscela. Durante la procedura di legame, il peptide richiesto viene concentrato e raccolto in forma purificata. IEX è un metodo ad alta risoluzione e capacità.

Cromatografia delle interazioni idrofobiche (HIC)

In questa tecnica viene utilizzato il principio di idrofobicità. L’interazione di un peptide con la superficie idrofoba di un mezzo cromatico consente l’isolamento dei peptidi desiderati. Inoltre, questo contatto è reversibile, consentendo la concentrazione e la purificazione del peptide. Inoltre, un tampone con un’elevata forza ionica migliora il processo, rendendo HIC un approccio di purificazione altamente efficace da utilizzare dopo una procedura di purificazione con eluizione di sale (come la tecnica IEX).

I campioni in una soluzione ad alta forza ionica si legano e vengono posti su una colonna durante l’HIC. Successivamente, l’eluizione con concentrazioni di sale inferiori porta all’eluizione differenziale dei composti legati. L’uso di solfato di ammonio per diluire il campione su un gradiente decrescente è un modo comune di applicazione. Successivamente, il peptide desiderato viene estratto in uno stato concentrato e purificato. Di conseguenza, HIC ha un alto livello di risoluzione e capacità di campionamento.

Filtrazione gel (GF)

Sfruttando la differenza di dimensioni molecolari tra i peptidi ei contaminanti, la gel filtrazione isola i peptidi. Di conseguenza, il GF viene utilizzato solo in campioni di volume modesto. Ma, d’altra parte, questo metodo offre un buon risultato.

Cromatografia in fase inversa (RPC)

Questa tecnica di purificazione fornisce un’alta risoluzione e separa i peptidi dalle impurità sfruttando l’interazione reversibile tra le molecole bersaglio e la superficie idrofoba di un mezzo cromatografico. Le circostanze vengono quindi modificate in modo che i composti legati vengano eluiti in un ordine diverso. Poiché il legame iniziale è solido a causa della natura delle matrici a fase inversa, per l’eluizione sono spesso necessari solventi organici e altri additivi.

L’eluizione viene solitamente eseguita aumentando la concentrazione di solventi organici, il più delle volte acetonitrile. Le potenti molecole che derivano dal processo di legame vengono successivamente purificate. Con i campioni di peptidi e oligonucleotidi, l’RPC viene spesso utilizzato come fase di lucidatura. È eccellente per la mappatura dei peptidi e altre separazioni analitiche. Tuttavia, l’RPC non è una procedura di purificazione ideale se sono richiesti il ripristino dell’attività e il ripristino di una struttura terziaria adeguata. Questo perché i solventi organici possono denaturare molti peptidi.

Rispetto delle GMP

Particolare attenzione deve essere prestata alla conformità alle GMP durante le operazioni di sintesi e purificazione dei peptidi. Ciò garantisce che il peptide finale sia puro e di ottima qualità. I metodi chimici e analitici devono essere accuratamente documentati per essere conformi alle GMP. Prima di avviare il processo di fabbricazione, è necessario impostare procedure e requisiti di prova per garantire che il processo sia controllato e ripetibile.

La fase di purificazione della sintesi peptidica ha requisiti GMP molto rigorosi. Questo passaggio è in ritardo nel processo di sintesi generale e ha un impatto sostanziale sulla qualità del peptide finale. Di conseguenza, devono essere stabilite azioni e parametri essenziali e i loro confini affinché il processo sia ripetibile entro quei vincoli predeterminati.

• Il caricamento della colonna è un parametro critico nel processo di purificazione dei peptidi.
• La velocità di flusso.
• Le prestazioni delle colonne.
• Metodi di pulizia delle colonne.
• La composizione del tampone di eluizione.
• La quantità di tempo impiegato nel processo di memorizzazione dei dati.
• Le frazioni sono raggruppate.

My Peptides segue i processi di sintesi e purificazione più rigorosi del settore. Come risultato del nostro impegno verso questi criteri, la nostra organizzazione può produrre peptidi più puri del 99% e adatti a qualsiasi progetto di ricerca o applicazione.